Каждая новая серия краски может быть использована для дифференциации только после предварительной проверки ее действия в параллельных опытах дифференциации с указанными эталонными — референтными штаммами. Как уже упоминалось, международными референтными штаммами являются Вг. abortus 544, Вг. melitensis 16-М, Вг. suis 1330. Биохимическая характеристика этих штаммов приведена в табл. 28.
Концентрация краски подбирается при помощи эталонных штаммов бруцелл: испытуемые краски добавляются к среде в различных количествах, например для тионина в концентрациях от 1 15 000 до 1 : 50 000. Концентрация краски в среде, с которой получается четкая дифференциация с эталонными штаммами бруцелл, и является рабочей дозой данной краски.
Постановка опыта дифференциации по краскам. Испытуемые штаммы и одновременно с ними эталонные штаммы всех трех типов бруцелл пересевают на косой печеночный агар и выращивают в термостате при 37 на протяжении 2 суток.
Полученные культуры проверяют на диссоциацию с трипафлавином.
В стандартную пробирку с физиологическим раствором переносят одну петлю 48-часовой культуры бруцелл, снятой с агара. Для получения гомогенной эмульсии петлю с культурой растирают на стенке пробирки и постепенно эмульгируют в физиологическом растворе. Густоту взвеси устанавливают 1 млрд. микробных клеток в 1 мл по стандарту мутности Государственного научного контрольного института имени Тарасевича. Посев стандартных — референтных и испытуемых штаммов в пробирки с полужидким или твердым агаром, содержащим тионин и фуксин, производят стандартной платиновой петлей (диаметр 2 мм) из взвеси, содержащей в 1 мл 1 млрд. микробных клеток. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37° в течение 6 дней. Учет результатов производят. 3 раза через каждые 2 дня.